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              ELISA實驗原理及方法

                    酶聯免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。它是應用最多的一種免疫酶技術。ELISA試劑盒(ELISAKits)已成為藥物和植物病理學研究中的常用診斷工具,是檢測組織提取液、血清和細胞培養液中目標抗體/抗原的理想工具,也是重要的質量控制手段。

              一、主要實驗原理:

              包被:抗原或者抗體能以物理性吸附于固相載體表面,原因是蛋白質和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,吸附之后能保持抗原抗體反應等免疫活性;

              標記:抗原或者抗體可通過共價鍵與酶連接成酶結合物,而此種酶結合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特點;

              顯色:酶結合物與相應包被在固相載體的抗原或者抗體結合后,也被固定在固相載體上,加入酶的底物之后可出現顯色反應,根據反應的顏色深淺可計算抗原或者抗體的相對含量。

              二、ELISA實驗的方法:

              1、雙抗夾心法

              雙抗夾心法常用于抗原、蛋白等檢測。因為靶標夾在包被在孔上的捕獲抗體和檢測抗體之間,故稱之為雙抗夾心法。一般分為:雙抗體夾心法和雙抗原夾心法,前者用于檢測抗原,后者用于檢測抗體。與間接法相比,具有優越的靈敏度和特異性。主要針對至少2個抗原決定簇的多價抗原。

              臨床上具有2個抗原決定簇的多價抗原有很多,比較常見有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。檢測步驟為:先將純化的相應抗體包被在固相載體上,再加入待測樣品,若其中含有待測抗原就會與固相抗體結合,洗掉雜質后,再加入酶標記的檢測抗體進行反應,洗掉多余的酶標抗體后,加入底物顯色,顯色與否以及顏色的深淺就代表了待測抗原是否存在以及相對含量。

              2、競爭法

              競爭法ELISA一般用于檢測小分子抗原。小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,無法同時與兩種抗體結合因此不能用雙抗體夾心法進行測定,故可以采用競爭法模式。一般常用于小分子、lgA、lgG、lgM等檢測。該技術測抗原的原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多,結合在固相上的酶標抗原愈少,最后的顯色也愈淺。

              3、間接法

              是檢測抗體最常用也最簡單的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相抗原結合的受檢抗體,故稱為間接法。間接法具有一些特點:1.酶標記抗抗體可選擇性檢測抗體的亞型,可用于鑒別感染時期;2.酶標抗抗體檢測抗體特異性不高,容易產生假陽性。臨床上常用該方法檢測抗HCV抗體、抗HEV抗體、抗CMV抗體、抗HSV抗體、抗沙眼衣原體抗體等。

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